Descongelación y siembra de hepatocitos hepáticos primarios | Protocolo en video
Índice de contenidos:
- Introducción
- Preparación del baño de agua a 37 grados Celsius
- Descongelación de hepatocitos cryopreserved
- Preparación del medio de descongelación
- Centrifugación y resuspensión de los hepatocitos
- Recuento celular y cálculo de viabilidad
- Siembra de hepatocitos en placas
- Incubación y alimentación de las células
- Procedimiento para placas con superposición
- Procedimiento para placas sin superposición
- Conclusión
Introducción
En Lonza Bioscience Solutions, formamos parte del segmento de Ciencias de la Vida de Lanza, y nuestro objetivo es brindar a los investigadores de ciencias de la vida las herramientas necesarias para desarrollar y probar terapéuticos, desde la investigación básica hasta la liberación del producto final. Nos comprometemos a apoyar a los científicos brindando células hepáticas de alta calidad y proporcionando instrucciones técnicas expertas sobre el uso de nuestros productos.
1. Preparación del baño de agua a 37 grados Celsius
Antes de comenzar el protocolo de descongelación y siembra de hepatocitos, es necesario preparar un baño de agua a 37 grados Celsius. Esto se logra llenando una bañera con agua a la temperatura deseada y asegurándose de que esté correctamente calibrada.
2. Descongelación de hepatocitos cryopreserved
Los hepatocitos cryopreserved se almacenan en viales en un congelador. Para descongelarlos, se debe sumergir el vial verticalmente en el baño de agua caliente, teniendo cuidado de mantener el tapón del vial por encima de la línea de agua para evitar cualquier posible contaminación. El tiempo de descongelación recomendado es de 90 a 120 segundos.
3. Preparación del medio de descongelación
Mientras los hepatocitos se descongelan, es importante preparar el medio de descongelación. Esto se logra vertiendo una porción del medio en el vial original y luego transfiriendo el resto de las células a un tubo de cono de 50 ml. Después de suspender las células agitando suavemente el tubo, se centrifuga a temperatura ambiente según las pautas establecidas en el protocolo.
4. Centrifugación y resuspensión de los hepatocitos
Una vez completada la centrifugación, se debe desechar el sobrenadante y resuspender las células agregando el medio apropiado, tal como se describe en el protocolo. Para calcular la viabilidad y el rendimiento de los hepatocitos, se utiliza el método de exclusión con azul de tripano. Se recomienda contar las células manualmente para obtener resultados más precisos.
5. Siembra de hepatocitos en placas
La siembra de hepatocitos implica transferir las células resuspendidas a una placa de múltiples pocillos recubierta con colágeno. El volumen de medio de siembra necesario se determina utilizando las fórmulas proporcionadas en el protocolo. Cada pocillo debe recibir una cantidad específica de células, y se debe colocar la placa en un incubador a 37 grados Celsius con dióxido de carbono.
6. Incubación y alimentación de las células
Después de la siembra, las placas deben incubarse durante al menos cuatro a seis horas. Durante este tiempo, las células deben moverse en dirección sureste-oeste para garantizar una dispersión uniforme. Después de este período, se retira el medio de siembra y se reemplaza con medio de mantenimiento tibio o medio específico para la aplicación.
7. Procedimiento para placas con superposición
Si se utiliza una superposición en las placas, se debe enfriar el medio de mantenimiento en hielo. La concentración de proteínas en la matriz de superposición se encuentra en la hoja de especificaciones correspondiente. Utilizando la fórmula provista en el protocolo, se determina la cantidad de matriz de superposición que se debe agregar al medio de mantenimiento enfriado. Después de reemplazar el medio de siembra con la solución de superposición, se incuba la placa durante al menos dos horas antes de su uso.
8. Procedimiento para placas sin superposición
Si no se utiliza una superposición, se reemplaza el medio de siembra con medio de mantenimiento tibio. El volumen de medio de mantenimiento requerido se indica en el protocolo. Para alimentar las células, se reemplaza diariamente el medio de mantenimiento siguiendo las indicaciones de volumen proporcionadas.
Conclusión
En resumen, el protocolo de descongelación y siembra de hepatocitos cryopreserved es una parte crucial del proceso de investigación en ciencias de la vida. Siguiendo los pasos adecuados y utilizando los medios apropiados, los investigadores pueden obtener células hepáticas de alta calidad y confiables para sus experimentos.
Destacados
- Proporcionamos hepatocitos cryopreserved de alta calidad para investigadores de ciencias de la vida.
- Nuestro protocolo detallado guía a los usuarios en el proceso de descongelación y siembra de hepatocitos.
- La siembra adecuada de las células es esencial para obtener resultados confiables en los experimentos.
Preguntas frecuentes
Q: ¿Cuál es la temperatura recomendada para el baño de agua en el paso 1?
A: La temperatura recomendada es de 37 grados Celsius.
Q: ¿Cuánto tiempo se recomienda para la descongelación de hepatocitos cryopreserved en el paso 2?
A: Se recomienda descongelar los hepatocitos durante 90 a 120 segundos.
Q: ¿Por qué es importante contar las células manualmente en el paso 4?
A: Contar las células manualmente proporciona resultados más precisos en términos de viabilidad y rendimiento.
Q: ¿Cuánto tiempo se debe incubar la placa después de la siembra en el paso 6?
A: Se recomienda incubar la placa durante al menos cuatro a seis horas.
Q: ¿Qué se debe hacer después de reemplazar el medio de siembra en el paso 7 en placas con superposición?
A: Después de reemplazar el medio de siembra, se debe incubar la placa durante al menos dos horas antes de su uso.
Q: ¿Cuándo se debe reemplazar el medio de mantenimiento en placas sin superposición?
A: El medio de mantenimiento debe reemplazarse diariamente siguiendo las indicaciones de volumen en el protocolo.
Recursos:
AI SEO Assistant
WHY YOU SHOULD CHOOSE Proseoai
