Primärhepatocyten auftauen und einplattieren - Schritt-für-Schritt-Anleitung

Tabelle des Inhalts:

1. Einführung in Lonza Bioscience Solutions
2. Bereiten Sie Ihren biologischen Sicherheitsschrank vor
3. Das Auftauen und Einplattieren von Primärhepatocyten
4. Zellzählen und Bestimmung der Vitalität
5. Einplattieren von Hepatocyten
6. Inkubation der Zellen
7. Fütterung der Zellen mit Wartungsmedium
8. Verwendung von Überlagerungen
9. Pflege der Zellen
10. Kontaktieren Sie unser wissenschaftliches Support-Team

Einplattieren von Primärhepatocyten ※

Lonza Bioscience Solutions ist Teil des Pharma- und Biotech-Segments von Lonza. Wir bieten Life-Science-Forschern die Werkzeuge, die sie für die Entwicklung und Prüfung von Therapeutika benötigen, von der Grundlagenforschung bis zur Endproduktfreigabe. Unser Engagement gilt der Unterstützung von Wissenschaftlern durch Bereitstellung hochwertiger Hepatozyten und fachkundiger technischer Anweisungen zur Verwendung unserer Produkte. Bevor Sie unsere kryokonservierten Zellen verwenden, lesen Sie bitte das Protokoll zum Auftauen und Einplattieren von Primärhepatocyten vollständig durch. Stellen Sie außerdem sicher, dass Ihr biologischer Sicherheitsschrank für das Auftauen und Einplattieren vorbereitet ist.

Bereiten Sie Ihren biologischen Sicherheitsschrank vor

Um einen reibungslosen Ablauf des Auftau- und Einplattiervorgangs zu gewährleisten, ist es wichtig, Ihren biologischen Sicherheitsschrank entsprechend vorzubereiten. Starten Sie mit einem 37 Grad Celsius Wasserbad und erwärmen Sie das passende Medium für Ihre Anwendung darin. Desinfizieren Sie den konischen Zentrifugenbehälter, der das Medium enthält, und übertragen Sie ihn dann in den biologischen Sicherheitsschrank. Entfernen Sie die kryokonservierten Hepatozyten schnell aus ihrem Lagerort im Wasserbad und tauchen Sie so viel wie möglich vom Vial in das Wasser ein, während der Kappenbereich über der Wasseroberfläche bleibt, um mögliche Kontamination zu vermeiden. Lassen Sie das Vial für 90 bis 120 Sekunden auftauen. Desinfizieren Sie das Vial nach dem Auftauen und übertragen Sie es in den biologischen Sicherheitsschrank.

Das Auftauen und Einplattieren von Primärhepatocyten

Bereiten Sie das Auftaumedium vor, indem Sie eventuell gebildete Bläschen in der Flüssigkeit entfernen, um sicherzustellen, dass alle Hepatozyten übertragen werden. Pipettieren Sie 1 ml des Auftaumediums zurück in das ursprüngliche Vial und gießen Sie die verbleibenden Zellen zurück in den 50-ml-Zentrifugenbehälter mit Auftaumedium. Schwenken Sie den 50-ml-Behälter vorsichtig per Hand, um die Zellen zu suspendieren. Zentrifugieren Sie den konischen Zentrifugenbehälter bei Raumtemperatur gemäß den Richtlinien im Protokoll und entfernen Sie anschließend den Behälter aus der Zentrifuge. Gießen Sie das Überständige in einen Abfallbehälter ab oder pipettieren Sie es ab. Resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie das im zugehörigen Protokoll angegebene Medium hinzufügen.

Zellzählen und Bestimmung der Vitalität

Verwenden Sie die Tripanblau-Exklusionsmethode, um die Vitalität und Ausbeute Ihrer Hepatozyten zu berechnen. Aufgrund der dualen Kerne, die in vielen Hepatozytenarten vorkommen, wird eine manuelle Zählung bevorzugt und liefert die genauesten Ergebnisse hinsichtlich der Vitalität und Ausbeute. Um die Plättchendichte zu erreichen, die Sie wünschen, verwenden Sie die im Protokoll angegebenen Formeln, um das Volumen des Einplattierungsmediums zu bestimmen, das Sie Ihrem aktuellen Zellbestand hinzufügen sollen. Übertragen Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette Hepatozyten auf eine kollagenbeschichtete Mehrfach-Wellenplatte. Lesen Sie das Protokoll, um das korrekte Volumen des Zellbestands für jede Vertiefung zu erfahren und eine Schätzung der Zellen pro Vertiefung zu erhalten.

Einplattieren von Hepatocyten

Platzieren Sie die Platte in einen CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind. Bewegen Sie die Platten in einer Süd-Ost-West-Bewegung und wiederholen Sie diese Schüttelbewegung nach 15, 30, 45 und 60 Minuten nach dem Einplattieren. Für 96-Well-Platten füllen Sie die Vertiefungen mit 50 Mikrolitern Medium und fügen dann 50 Mikrolitern Zellen hinzu. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und aspirieren Sie das Medium vorsichtig ab. Ersetzen Sie es durch frisches Einplattierungmedium gemäß den im Protokoll angegebenen Volumina. Inkubieren Sie die Zellen mindestens vier bis sechs Stunden lang.

Inkubation der Zellen

Nach vier bis sechs Stunden Inkubation unterscheidet sich das Verfahren je nach Vorhandensein einer Überlagerung oder dem Fehlen einer Überlagerung in den Vertiefungen. Wenn Sie keine Überlagerung verwenden, ersetzen Sie das Medium durch warmes Wartungsmedium oder ein auf Ihre Anwendung abgestimmtes Medium. Wenn Sie eine Überlagerung verwenden, kühlen Sie das Wartungsmedium auf Eis und verwenden Sie das Protokoll, um das Volumen des Wartungsmediums zu bestimmen, das Sie hinzufügen müssen, um Ihre Platte zu füttern. Ermitteln Sie die Proteinkonzentration der Überlagerungsmatrix anhand des Datenblatts und verwenden Sie die im Protokoll angegebene Formel, um die Menge der Überlagerungsmatrix zu berechnen, die dem gekühlten Wartungsmedium hinzugefügt werden soll. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator, aspirieren Sie das Einplattierungmedium aus jeder Vertiefung und ersetzen Sie es durch kalte Überlagerungslösung entsprechend den in der Anleitung angegebenen Volumina für jede Vertiefung. Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator und inkubieren Sie sie mindestens zwei Stunden, bevor Sie sie verwenden. Ersetzen Sie das Wartungsmedium täglich gemäß den im Protokoll angegebenen Volumina.

Verwendung von Überlagerungen

Überlagerungen können bei der Kultivierung von Hepatozyten verwendet werden, um eine bessere Zellumgebung zu schaffen und bestimmte Nachahmungen der In-vivo-Bedingungen zu ermöglichen. Um Überlagerungen zu verwenden, entfernen Sie das Einplattierungmedium und ersetzen Sie es durch kalte Überlagerungslösung gemäß den im Protokoll angegebenen Volumina. Stellen Sie sicher, dass die richtige Menge der Überlagerungsmatrix zum gekühlten Wartungsmedium hinzugefügt wird, indem Sie die im Protokoll angegebene Formel verwenden.

Pflege der Zellen

Die Pflege der Hepatozyten ist ein wichtiger Teil des Prozesses, um die Zellen lebensfähig und funktionsfähig zu erhalten. Die Platten sollten täglich gemäß den im Protokoll angegebenen Volumina mit frischem Wartungsmedium gefüttert werden. Stellen Sie sicher, dass die Platten in einem CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius gehalten werden, um optimale Wachstumsbedingungen zu gewährleisten. Befolgen Sie die Anweisungen im Protokoll für weitere spezifische Details zur Pflege Ihrer Hepatozyten.

Kontaktieren Sie unser wissenschaftliches Support-Team

Wenn Sie Hilfe benötigen oder Fragen zum Auftau- und Einplattierungsprozess Ihrer Primärhepatocyten haben, zögern Sie nicht, sich an unser wissenschaftliches Support-Team zu wenden. Unsere erfahrenen Mitarbeiter stehen Ihnen zur Verfügung, um Ihnen bei Ihren Anliegen weiterzuhelfen und Ihnen Unterstützung zu bieten.

Highlights:

• Lonza Bioscience Solutions bietet Forschern im Bereich Life Sciences die erforderlichen Werkzeuge für die Entwicklung und Prüfung von Therapeutika.
• Das Auftauen und Einplattieren von Primärhepatocyten erfordert eine sorgfältige Vorbereitung des biologischen Sicherheitsschranks.
• Die Tripanblau-Exklusionsmethode wird empfohlen, um die Vitalität und Ausbeute der Zellen zu bestimmen.
• Das Einplattieren der Hepatozyten erfolgt auf kollagenbeschichteten Mehrfach-Wellenplatten.
• Die Pflege der Zellen erfordert eine regelmäßige Fütterung mit frischem Wartungsmedium.

FAQ: Q: Wie lange sollten die Hepatozyten inkubiert werden? A: Die Zellen sollten mindestens vier bis sechs Stunden inkubiert werden, bevor weitere Schritte durchgeführt werden.

Q: Was ist der Zweck einer Überlagerung? A: Überlagerungen schaffen eine bessere Zellumgebung und ermöglichen eine Nachahmung der In-vivo-Bedingungen.

Q: Wie oft sollte das Wartungsmedium ersetzt werden? A: Das Wartungsmedium sollte täglich gemäß den im Protokoll angegebenen Volumina ersetzt warden.

Q: Wie kann ich das wissenschaftliche Support-Team kontaktieren? A: Sie können das wissenschaftliche Support-Team von Lonza Bioscience Solutions kontaktieren, um Hilfe und Unterstützung zu erhalten.

Ressourcen:

• Lonza Bioscience Solutions Website: [Website-URL]
• Protokoll zum Auftauen und Einplattieren von Primärhepatocyten: [Protokoll-URL]