Primer Hepatositleri Çözme ve Plakaya Ekme | Video Protokolü

İçindekiler:

1. Giriş
2. Kullanılacak Malzemeler
3. Kriyoprezerve Hücrelerin Çözülmesi
4. Çözülme Ortamının Hazırlanması
5. Hücre Sayımı
6. Hücrelerin Kaplama Oranının Belirlenmesi
7. Kaplama Ortamının Hazırlanması
8. Hücrelerin Plaka Üzerine Ekilmesi
9. Plaka İnkübatörde Tutulması
10. Sonuç ve Geri Bildirim

🧪 İçeriğin Destemize Edilmesi ve Plaka Üzerine Hücre Ekimi

Lonza Bioscience Solutions, Lanza'nın ilaç ve biyoteknoloji segmentinin bir parçasıdır. Hayat bilimleri araştırmacılarına temel araştırmalardan nihai ürün çıkışına kadar geliştirmeleri ve tedavi denemeleri için ihtiyaç duydukları araçları sağlamaktayız. Ürünlerimizin kullanımıyla ilgili olarak bilim adamlarını desteklemek için, yüksek kaliteli karaciğer hücreleri ve uzman teknik talimatlar sunuyoruz.

🧪 Kullanılacak Malzemeler

Bu protokolü uygulamak için aşağıdaki reaktiflere ve malzemelere ihtiyacınız olacaktır:

• 37 derece Celsius su banyosu
• Uygun ortamı su banyosunda ısıtma
• Konik tüp içindeki ortamı sterilize etme
• Kriyoprezerve edilmiş hepatositleri hızlı bir şekilde çözmek için vial
• Çözülme ortamını hazırlamak için 50 ml'lik tüp
• İçinde hepatositlerin merkefüjlenmesi için 50 ml'lik tüp
• Merkefüjden sonra supernatanı almak için atık şişesi veya pipetleme
• İlgili protokolde belirtilen uygun ortam
• Hücre sayımı için tripan mavisi
• Plaka üzerine ekim yapmak için kaplama ortamı
• Multiwell plaka üzerine hepatosit transferi için 1 ml'lik pipetçi
• 37 derece Celsius karbondioksit inkübatörü

🧪 Kriyoprezerve Hücrelerin Çözülmesi

Kriyoprezerve edilmiş hepatositleri doğru şekilde çözmek ve plaka üzerine ekim yapmak için aşağıdaki adımları izleyin:

1. Çözülme ortamını hazırlayın ve 37 derece Celsius su banyosunda ısıtın.
2. Kriyoprezerve edilmiş hepatositleri orijinal saklama yerinden çıkarın ve vialin kapağı su hattının üzerinde kalacak şekilde su banyosuna dikey olarak yerleştirin.
3. Viali 90 ila 120 saniye boyunca çözün.
4. Viali sterilize edin ve biyolojik güvenlik dolabına transfer edin.
5. Çözülme ortamının içinde oluşan kabarcıkları patlatın ve tüp içindeki hücreleri tekrar karışım yapmak için dikkatlice sallayın.
6. Konik tüpü merkefüjde oda sıcaklığında merkezleyin. Merkefüjleme hızı ve süresi hakkındaki talimatları protokolden bulun.
7. Tüpü merkefüjden çıkarın, sterilize edin ve biyolojik güvenlik dolabına transfer edin.
8. Supernatanı atık şişesine dökün veya alın.
9. İlgili protokolde belirtilen uygun ortamı ekleyerek hücreleri yeniden süspansiyon haline getirin.

🧪 Hücre Sayımı

Hücre sayımı yapmak için tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak hücre canlılığını ve verimini hesaplayın. İşte adımlar:

1. Hücre numaralandırmak için bir lam taşı hazırlayın.
2. Hücre süspansiyonunu tripan mavisi ile karıştırın ve numaralandırma lamına bir damla uygulayın.
3. Lamı mikroskop altında inceleyin ve canlı ve ölü hücreleri sayın.
4. Protokolde belirtilen formülü kullanarak hücre canlılığını ve verimini hesaplayın.

🧪 Hücrelerin Kaplama Oranının Belirlenmesi

Hücrelerin kaplama oranını belirlemek, plakaya ekilecek hücrelerin uygun yoğunluğunu sağlamak için önemlidir. İlgili protokoldeki formülleri kullanarak aşağıdaki adımları izleyin:

1. Mevcut hücre stokunuzun hacmini belirlemek için formülleri kullanın.
2. Hücre yoğunluğunuzun istenen hücre yoğunluğunu elde etmek için kaplama ortamına eklenen hacmini belirlemek için formülleri kullanın.

🧪 Kaplama Ortamının Hazırlanması

Hücreleri plaka üzerine ekmek için uygun kaplama ortamını hazırlamak için aşağıdaki adımları izleyin:

1. İlgili protokolden elde ettiğiniz hacimleri kullanarak kaplama ortamını hazırlayın.

🧪 Hücrelerin Plaka Üzerine Ekilmesi

Hücreleri plaka üzerine ekmek için aşağıdaki adımları izleyin:

1. Collagen kaplı multiwell plakasına hücrelerin transferi için 1 ml'lik pipettörü kullanın.
2. Her kuyuya eklenecek hücre stokunun doğru hacmini ve kuyudaki hücre sayısının tahminini belirlemek için protokole bakın.
3. Plakayı 37 derece Celsius karbondioksit inkübatöre yerleştirin.
4. Hücrelerin eşit şekilde dağıldığından emin olmak için plakayı güneydoğu-batı-yöne doğru hareket ettirin.
5. 15, 30, 45 ve 60 dakikada bir sallama hareketini tekrarlayın.
6. 96 kuyulu plakalar için, kuyuları 50 mikrolitre ortam ile doldurun ve ardından 50 mikrolitre hücre ekleyin.
7. Plakayı inkübatörden çıkarın ve ortamı dikkatlice alın.
8. İlgili protokolden belirtilen hacimlerle taze kaplama ortamıyla değiştirin.
9. Plakayı en az dört ila altı saat boyunca inkübe edin.

🧪 Plakada İnkübatörde Tutulması

Plaka inkübatörde tutulurken aşağıdaki adımları izleyin:

1. Overlay kullanılmıyorsa, sıcak bakım ortamı veya uygulamaya özgü ortam ile ortamı değiştirin.
2. Overlay kullanılıyorsa, overlay matrisinin protein konsantrasyonunu ve ilgili protokolden alınan formülü kullanarak ne kadar overlay matrisinin bakım ortamına ekleneceğini belirleyin.
3. Plakayı inkübatörden çıkarın ve her kuyudan plaka ortamını alın.
4. Soğuk overlay çözeltisi ile değiştirin, protokolden belirtilen hacim kılavuzlarını takip edin.
5. Plakayı inkübatöre geri yerleştirin ve en az iki saat boyunca inkübe edin.
6. Bakım ortamını her gün protokolden belirtilen hacimlerle değiştirin.

🔍 Sonuç ve Geri Bildirim

Bu protokol, kriyoprezerve hepatositlerin çözülmesi ve plaka üzerine ekilmesi için adımları kapsamaktadır. Lütfen her adımı dikkatlice takip edin ve teknik talimatları tam olarak uygulayın. Sorularınız için bilimsel destek ekibimizle iletişime geçmekten çekinmeyin.

🙋 En Sık Sorulan Sorular

S: Kriyoprezerve hepatositleri nasıl doğru bir şekilde çözebilirim?

C: Kriyoprezerve edilmiş hepatositleri su banyosunda çözdükten sonra, çözülme ortamını hazırlayarak ve dikkatlice sallayarak hücreleri süspansiyon haline getirin.

S: Hücre sayımını hangi yöntemle yapabilirim?

C: Hücre sayımı için tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak hücre canlılığını ve verimini hesaplayabilirsiniz.

S: Hücreleri plaka üzerine eklerken nelere dikkat etmeliyim?

C: Hücreleri plaka üzerine ekerken pipetleme işlemini dikkatlice yapmalı ve doğru hacimleri kullanmalısınız. Ayrıca plakayı inkübatörde uygun süre boyunca tutmanız önemlidir.

S: Bakım ortamını ne sıklıkla değiştirmeliyim?

C: Bakım ortamını günlük olarak değiştirmelisiniz. Protokolden belirtilen hacimleri kullanarak taze ortamı plakaya ekleyin.

🌐 Kaynaklar

Lonza Bioscience Solutions. (URL)